TARIFNAME WO2005056584
Mevcut buluş, ciddi akut solunum sendromu (SARS) ile ilişkili, 031589 numarası altında listelenen ve Hanoi'de (Vietnam) alınan bir örnekten kaynaklanan yeni bir korona virüsü suşu ile ilgilidir. , genomundan türetilen nükleik asit moleküllerine, bahsedilen nükleik asit molekülleri tarafından kodlanan proteinlere ve peptitlere ve bunların uygulamalarına, özellikle teşhis reaktifleri ve / veya bir aşı olarak.
Koronavirüs, pozitif hücreli, konakçı hücrelerin sitoplazmasında replike olan yaklaşık 30 kilobazlık tek sarmallı bir RNA virüsüdür; genomun 5 'ucu bir kapak yapısına ve 3' ucu bir poliA kuyruğuna sahiptir. Bu virüs sarılır ve yüzeyinde spiküller adı verilen peplomerik yapılar içerir.

Genom, 5-ucundan 3-ucuna kadar aşağıdaki açık okuma çerçevelerini veya ORF'yi içerir: ORF la ve transkripsiyon-replikasyon kompleksinin proteinlerine karşılık gelen ORFlb ve ORF-S, ORF-E, ORF-M ve S, E, M ve N yapısal proteinlerine karşılık gelen ORF-N içerir. Ayrıca, kodlandığı bilinmeyen proteinlere karşılık gelen ORF'leri içerir: ORF-S ve ORF-E arasında bulunan ve ikincisinin üst üste binen bölgesi , ORF-M ve ORF-N arasındaki bölge ve ORF-N'ye dahil olan bölge. 

Protein S, viral zarfın yüzeyinden çıkan spiküller veya "sivri" formunda olan bir membran glikoproteindir (200-220 kDa). Virüsün konakçı hücredeki reseptörlere bağlanmasından ve viral zarfın hücre zarı ile füzyonunun indüklenmesinden sorumludur.

Yaklaşık 10 kDa'lık glikosile edilmemiş bir trans-membran proteini olan sM (küçük zar) olarak da bilinen küçük zarf proteini (E), viriondaki en düşük miktarda bulunan proteindir. Endoplazmik retikulum ve Golgi aparatındaki ara bölme seviyesinde oluşan koronavirüslerin tomurcuklanma sürecinde itici bir rol oynar M proteini veya matris proteini (25-30 kDa) bir membran glikoproteinidir. bol miktarda viral partikül içine entegre M / E etkileşimi, S'nin parçacıklara katılması bir S / M etkileşimi tarafından yönlendirilir. Koronavirüslerin viral olgunlaşması ve viral partiküllerin toplandığı yerin belirlenmesi için önemli gibi görünmektedir.

Koronavirüslerin yapısal proteinleri arasında en fazla korunan protein N veya nükleokapsid proteini (45-50 kDa), genomik RNA'nın kapsüllenmesi ve daha sonra bunun virion içine yönlendirilmesi için gereklidir. Bu protein muhtemelen RNA replikasyonu ile de ilgilidir.

Bir konakçı hücre enfekte olduğunda, viral genomun 5 '' i bulunan okuma çerçevesi (ORF), viral proteazlar tarafından yarılan ve daha sonra RNA polimeraz RNA gibi çeşitli yapısal olmayan proteinleri serbest bırakan bir poliproteine çevrilir. bağımlı (Rep) ve ATPase helisaz (Hel). Bu iki protein, viral genomun replikasyonu ve viral proteinlerin sentezinde kullanılan transkriptlerin üretilmesinde rol oynar. Bu alt genomik mRNA'ların üretildiği mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır; bununla birlikte, son gerçekler, her genin 5 ′ ucundaki transkripsiyonu düzenlemek için sekansların, subgenomik mRNA'ların süreksiz transkripsiyonunu düzenleyen sinyalleri temsil ettiğini gösterir.

Viral zarın proteinleri (S, E ve M proteinleri) ara bölmeye sokulurken, çoğaltılan RNA (iplik +) protein N (nükleokapsid) ile birleşir. Bu protein-RNA kompleksi daha sonra endoplazmik retikulumun zarlarında bulunan protein M ile birleşir ve endoplazmik retikulumdaki nükleokapsid kompleks tomurcukları olduğunda viral partiküller oluşur. Virüs daha sonra Golgi kompleksinden göç eder ve sonunda hücreyi, örneğin ekzositoz yoluyla terk eder. Virüsün konakçı hücreye bağlanma yeri, S proteini seviyesindedir.

Koronavirüsler insanlarda soğuk algınlığının% 15 ila 30'undan ve özellikle kedilerde (FIPV: Feline bulaşıcı peritonit virüsü), kümes hayvanlarından (IBV: Kuş Bulaşıcı bronşit virüsü), fare (MHV: Fare Hepatit virüsü), domuz (TGEV: Bulaşıcı gastroenteritit virüsü, PEDV: Domuz Epidemik İshal virüsü, PRCoV: Domuz Solunum Koronavirüsü, HEV: Hemaglütine edici ensefalomiyelit Virüsü) ve sığır (BcoV: Sığır koronavirüsü).

Genel olarak, her bir koronavirüs sadece bir türü etkiler; immünokompetan bireylerde, enfeksiyon, enfekte olmuş hücreleri yok edebilen muhtemelen nötralize edici antikorları ve hücresel bağışıklığı indükler.
İlk üç ayda farklı ülkelere (Vietnam, Hong-Kong, Singapur, Tayland ve Kanada) yayılan Şiddetli akut solunum sendromu (SARS veya Şiddetli akut solunum sendromu, Fransızca SARS) adı verilen atipik pnömoni salgını 2003, Çin'in 2002 yılının son çeyreğinde başlamasıyla başladı. Bu hastalığın şiddeti, mortalite oranı% 3 ila 6 civarındadır. Bu hastalığın etken maddesinin belirlenmesi dünyadaki birçok laboratuvar tarafından gerçekleştirilmiştir.

Mart 2003'te, şiddetli akut solunum sendromu vakaları ile ilişkili olarak yeni bir koronavirüs (Fransızca SARS-CoV, SARS virüsü veya SARS virüsü) izole edilmiştir (TG KSIAZEK ve diğerleri, New England Journal of Medicine 2003.348, 1319-1330; C. DROSTEN ve diğerleri, New England Tıp Dergisi, 2003.348, 1967-1976; Peiris ve diğerleri, Lancet, 2003.361, 1319-).
Bu yeni koronavirüsün genomik dizileri, özellikle Urbani izolatının (Genbank erişim numarası AY274119.3 ve A) genomik dizileri elde edildi.

MARRA ve ark., Science, 1 Mayıs 2003,300, 1399-1404) ve Toronto'dan izolat (Tor2, Genbank erişim no AY 278741 ve A. ROTA ve ark., Science, 2003,300, 1394 - 1399).

Genomun organizasyonu, bilinen diğer korona virüslerininkiyle karşılaştırılabilir, böylece SARS-CoV'nin Corotzaviridae familyasına üyeliğini doğrulamayı mümkün kılar; açık okuma çerçeveleri ORFla ve 1b ve S, E, M ve N proteinlerine karşılık gelen açık okuma çerçeveleri ve ayrıca kodlanan proteinlere: ORF-S ve ORF-E arasında bulunan bölge (ORF3), ORF-S ve ORF-E arasındaki bölge ve çakışan ORF-E (ORF4), ORF-M ve ORF-N arasındaki bölge (ORF7 - ORF ' 11) ve özellikle ORF-N'ye (ORF13 ve ORF 14) karşılık gelen bölge tanımlanmıştır.

Tor2 ve Urbani izolatlarının dizileri arasında yedi fark vurgulanmıştır; 3 sessiz mutasyonlara karşılık gelir (c / t konumunda
16622 ve ORFlb'nin 19064 pozisyonunda a / g, ORF-S'nin 24872 pozisyonunda t / c) ve 4 sırasıyla amino asit sekansını değiştirir: ORFla tarafından kodlanan proteinler (7919 pozisyonunda c / t A / V mutasyonuna karşılık gelen), protein S (A / S mutasyonuna karşılık gelen 23220 konumundaki g / t), ORF3 ile kodlanan protein (R / G mutasyonuna karşılık gelen 25298 konumundaki a / g) ve protein M (S / P mutasyonuna karşılık gelen 26857 konumundaki t / c).

Ek olarak, filogenetik analiz SARS-CoV'nin diğer koronavirüslerden uzak olduğunu ve ne insan solunum koronavirüslerinin mutasyonuyla ne de bilinen koronavirüsler arasında rekombinasyonla ortaya çıktığını gösterir (bir inceleme için Holmes, JCI, 2003, 111, 1605-1609).

Yeni varyantların tanımlanması ve dikkate alınması, SARS için yeterince duyarlı ve spesifik tespit ve teşhis reaktiflerinin yanı sıra popülasyonları SARS salgınlarına karşı koruyabilen immünojenik kompozisyonların geliştirilmesi için önemlidir.

Mucitler şimdi SARS ile ilişkili Tor2 ve Urbani izolatlarından ayırt edilen başka bir koronavirüs suşunu vurguladılar.

Bu nedenle mevcut buluşun konusu, ciddi akut solunum sendromu ile ilişkili izole edilmiş veya saflaştırılmış bir insan koronavirüs suşudur, özelliği, genomunun tamamlayıcı DNA formunda, genin 23220-23222 pozisyonunda bir serin kodonuna sahip olmasıdır. ORF3 geninin 25298-25300 pozisyonunda protein S veya bir glisin kodonu ve ORFla'nın 7918-7920 pozisyonunda bir alanin kodonu veya protein M geninin 26857-26859 pozisyonunda bir serin kodonu, adı geçen pozisyonlar Genbank sekansı AY274119.3 referans alınarak belirtilmiştir.

Adı geçen suşun avantajlı bir düzenlemesine göre, genomunun DNA eşdeğeri, SEK.KİM.NO: 1 sekansına karşılık gelen bir sekansa sahiptir; bu koronavirüs suşu, SARS'li bir hastanın 031589 numarası altında listelenen ve Hanoi'deki (Vietnam) Fransız hastanesinde yürütülen bronkoalveoler lavaj örneğinden gelir.

Buluşa göre, bahsedilen DİZİ İD NO: 1 dizisi, yukarıda tanımlandığı gibi izole edilmiş koronavirüs suşunun genomunun ribonükleik asit molekülüne karşılık gelen deoksiribonükleik asit dizisidir.
DİZİ İD NO: 1 dizisi, aşağıdaki mutasyonlara sahip olması nedeniyle Genbank dizisi AY274119.3'ten (izole Tor2) farklıdır: - 23220 konumundaki g / t; Tor2 proteininin S amino asit sekansının 577 pozisyonundaki alanin kodonu (gct), bir 25258 pozisyonunda a / g serin kodonu (tct) ile değiştirilir; Tor2'nin ORF3'ü tarafından kodlanan proteinin amino asit dizisinin 11. konumundaki arginin kodonu (aga), bir glisin kodonu (gga) ile değiştirilir.

Ek olarak, DİZİ İD NO: 1 dizisi, aşağıdaki mutasyonlara sahip olması bakımından Genbanlc AY278741 (izole Urbani) dizisinden farklıdır: - 7919 pozisyonunda t / c; ORFla tarafından kodlanan proteinin amino asit sekansının 2552 pozisyonundaki valin kodonu (gtt) yerine bir alanin kodonu (gct), 16622 pozisyonunda - t / c konur: bu mutasyon asit sekansını değiştirmez ORFlb (sessiz mutasyon) tarafından kodlanan proteinlerin amino asitleri, 19064 pozisyonunda - g / a: bu mutasyon, ORFlb (sessiz mutasyon) ile kodlanan proteinlerin amino asit sekansını değiştirmez, - 24872 pozisyonunda c / t : bu mutasyon, protein S'nin amino asit dizisini ve 26857 pozisyonunda - c / t'yi değiştirmez: protein M'nin amino asit dizisinin 154. pozisyonundaki prolin kodonu (ccc) bir serin kodon ile değiştirilir (cc).
Herhangi bir özel kaydın olmaması durumunda, nükleotid ve peptit sekanslarının pozisyonları, Genbank sekansı AY274119.3 referans alınarak belirtilir.
Mevcut buluş ayrıca izole edilmiş veya saflaştırılmış bir polinükleotit ile ilgilidir, karakterize edici özelliği, sekansının, yukarıda tanımlandığı gibi izole edilmiş koronavirüs suşunun genomu olmasıdır.
Adı geçen polinükleotidin avantajlı bir düzenlemesine göre, SEK.KİM.NO: 1 sekansına sahiptir.

Mevcut buluş ayrıca izole edilmiş veya saflaştırılmış bir polinükleotit ile ilgilidir, karakterize edici özelliği, hibrit sekansının, yukarıda tanımlandığı gibi polinükleotit sekansı ile yüksek sertlikte koşullar altında olmasıdır.

İzole edilmiş veya saflaştırılmış ortalamalar değiştirildi. doğal durumdan insanın eliyle; başka bir deyişle, bir nesne doğada varsa, değiştirilmiş veya saf ortamından veya her ikisinden çıkarılmışsa saflaştırıldığı söylenir. Örneğin, canlı bir organizmada doğal olarak bulunan bir polinükleotid veya bir protein / peptit ne izole edilir ne de saflaştırılır; Öte yandan, klonlama, amplifikasyon ve / veya kimyasal sentez yoluyla elde edilen doğal ortamında birlikte varolan moleküllerden ayrılan aynı poli-nükleotid veya protein / peptit, mevcut buluşun anlamı dahilinde izole edilir. Ek olarak, bir organizmaya transformasyon, genetik manipülasyon veya başka bir yöntemle sokulan bir polinükleotid veya bir protein / peptit, adı geçen organizmada mevcut olsa bile izole edilir. Mevcut buluşta kullanıldığı şekliyle saflaştırılmış terimi, buluşa uygun proteinlerin / peptitlerin, örneğin konakçı hücre kültürünün saflaştırılmış ürünü gibi diğer proteinler veya polipeptitlerle herhangi bir ilişkisi olmadığı anlamına gelir. rekombinant veya rekombinant olmayan bir kaynaktan saflaştırılan ürün.

Mevcut buluşun amaçları doğrultusunda, yüksek sertliğe sahip hibridizasyon koşullarının, tamamlayıcı polinükleotitler arasında spesifik ve seçici hibridizasyonun korunmasına izin verecek şekilde seçilen sıcaklık ve iyonik kuvvet koşulları anlamına gelir.

Örnekleme yoluyla, yukarıdaki polinükleotitleri tanımlamak amacıyla yüksek sıkılık koşulları avantajlı olarak aşağıdaki gibidir: DNA-DNA veya DNA-RNA hibridizasyonu iki aşamada gerçekleştirilir: (1) 42'de ön hibridizasyon C, 5 x SSC (1 x SSC, 0.15 M NaCl + 0.015 M sodyum sitrat çözeltisine karşılık gelir),% 50 formamid,% 7 içeren fosfat tamponunda (20 mM pH 7.5) 3 saat süreyle sodyum dodesil sülfat (SDS), 10 x Denhardt,% 5 dekstran sülfat ve% 1 somon sperm DNA; (2) 42 ° C'de 20 saat hibridizasyon, ardından 2 x SSC +% 2 SDS içinde 20 ° C'de 20 dakika 2 yıkama, 0.1 x SSC +% 0.1 SDS içinde 20 ° C'de 20 dakika 1 yıkama. Son yıkama, 60 ° C'de 30 dakika boyunca 0.1 x SSC +% 0.1 SDS'de gerçekleştirilir.

Mevcut buluş ayrıca, yukarıda tanımlandığı gibi polinükleotidin bir temsilci fragmanı ile de ilgilidir, karakterize edici özelliği, tanıma yerleri, kısıtlama enzimleri kullanılarak elde edilebilmesidir. yukarıda tarif edildiği gibi adı geçen polinükleotitte doğum ve yarılma mevcuttur yukarıda, yukarıda tanımlandığı gibi adı geçen polinükleotit için spesifik oligonükleotit primerleri kullanılarak in vitro transkripsiyon veya kimyasal sentez yoluyla amplifıkasyon yoluyla. 

Adı geçen parçanın avantajlı bir düzenlemesine göre, aşağıdakilerden oluşan gruptan seçilir: ORFla, ORFlb, ORF-S, ORF-E arasından seçilen en az bir açık okuma çerçevesine (ORF) karşılık gelen cDNA, ORF-M, ORF-N, ORF3, ORF4, ORF7 ila ORF11, ORF13 ve ORF14 ve adı geçen polinükleotidin 5 ′ veya 3 ding kodlamayan uçlarına karşılık gelen cDNA.

Bu düzenlemenin avantajlı bir düzenlemesine göre, söz konusu fragmanın aşağıdakilerden oluşan gruptan seçilmiş bir sekansı vardır: - proteini kodlayan ORF-S'ye karşılık gelen cDNA'yı temsil eden DİZİ ID NO: 2 ve 4 dizileri S, - protein E'yi kodlayan ORF-E'ye karşılık gelen cDNA'yı temsil eden DİZİ ID NO: 13 ve 15 dizileri - l'e karşılık gelen cDNA'yı temsil eden DİZİ ID NO: 16 ve 18 dizilerinin dizileri 'Protein M'yi kodlayan ORF-M, - protein N'yi kodlayan ORF-N'ye karşılık gelen cDNA'yı temsil eden DİZİ ID NO: 36 ve 38 dizileri, - karşılık gelen cDNA'ları temsil eden diziler - söz: ORFla ve ORFlb'de (ORFlab, SEKANS KOD NO .: 31), ORF3 ve ORF4 (SEKANS KOD NO .: 7.8), ORF 7 ila 11 (SEKANS KOD NO .: 19.20), ORF13 ( SEK.KİM.NO: 32) ve ORF14 (SEK.KİM.NO: 34) ve - sırasıyla 5 uçlu (SEK.KİM.NO: 39 ve 72) ve 3'kodlamasızlarına karşılık gelen cDNA'ları temsil eden sekanslar bahsedilen polinükleotidin s (DİZİ ID NO: 40.73).

Mevcut buluş ayrıca yukarıda tanımlandığı gibi protein S için kodlanan cDNA'nın bir fragmanı ile ilgilidir, karakterize edici özelliği, SEK.KİM.NO: 5 ve 6 sekanslarından oluşan gruptan seçilen bir sekansa sahip olmasıdır. (fragmanlar Sa ve Sb).

Mevcut buluş ayrıca yukarıda tanımlandığı gibi ORFla ve ORFlb'ye karşılık gelen cDNA'nın bir fragmanı ile ilgilidir, karakterize edici özelliği
SEK.KİM.NO: 41 ila 54 sekanslarından oluşan gruptan seçilen bir sekansa sahip olması (LO ila L12 fragmanları).
Mevcut buluşun konusu ayrıca yukarıda tanımlandığı gibi polinükleotitin bir fragmanı olup, karakterize edici özelliği, bahsedilen suşun genom sekansının en az 15 ardışık bazına veya baz çiftlerine sahip olmasıdır. 7979.16262, 19064.23220, 24872.25298 ve 26857 pozisyonlarında. Tercihen, 20 ila 2500 baz veya baz çifti, tercihen 20 ila 400 arası bir fragmandır.
Adı geçen parçanın avantajlı bir düzenlemesine göre, aşağıdaki pozisyonlara karşılık gelen en az bir çift baz veya baz çifti içerir: 7919 ve 23220.7919 ve 25298, 16622 ve 23220,19064 ve 23220,16622 ve 25298, 19064 ve 25298 23220 ve 24872, 23220 ve 26857,24872 ve 25298,25298 ve 26857'de açıklanmaktadır.

Mevcut buluş ayrıca SARS ile ilişkili bir koronavirüs genomunun veya ikincisinin DNA eşdeğerinin bir fragmanını amplifiye edebilen en az 18 baz primerleri ile de ilgilidir.
Adı geçen primerlerin bir düzeneğine göre bunlar aşağıdakilerden oluşan gruptan seçilir: - sırasıyla 28507 ila 28522 (sens primeri, SEK.KİM.NO: 60) ve 28774 ila 28759 pozisyonlarına karşılık gelen n 1 primer çifti (primer antisens, DİZİ ID NO: 61) yukarıda tanımlandığı gibi polinükleotid dizisinin dizisi, - sırasıyla 28375 ila 28390 (primer anlamda, DİZİ ID NO: 62) ve 28702 pozisyonlarına karşılık gelen n'2 primer çifti - polinükleotit sekansının yukarıda tanımlandığı gibi 28687'ye (antisens primeri, SEQ İD N0: 63) ve - SEQ İD N0 55 ve 56 primerlerinden oluşan primer çifti.

Mevcut buluş ayrıca SARS veya bunun bir fragmanı ile ilişkili bir koronavirüs genomunun varlığını tespit edebilen bir prob ile ilgilidir, karakterize edici özelliği aşağıdakilerden oluşan gruptan seçilmesidir: bu tür fragmanlar Yukarıda tanımlandığı gibi polinükleotit sekansında aşağıdaki pozisyonlara karşılık gelen fragmanlar: 28561 ila 28586, 28588 ila 28608.28541 ila 28563 ve 28565 ila 28589 (SEKANS KOD NO .: 64 ila 67).

Buluşa göre problar ve primerler, saptanabilir ve / veya ölçülebilir bir sinyal elde etmek için teknikte uzman kişilerce iyi bilinen yöntemlerle radyoaktif veya radyoaktif olmayan bir bileşik ile doğrudan veya dolaylı olarak etiketlenebilir. Kullanılan radyoaktif izotoplar arasında 32p, 33P, 35S, 3H veya 1225I den bahsedilebilir. Radyoaktif olmayan varlıklar biyotin, avidin, streptavidin, digoksibenin, haptenler, boyalar, radyoluminesan, kemolüminesan, biyoluminesan, flüoresan, fosforesan gibi lüminesan ajanlar arasından seçilir. .
Buluş, yukarıdaki dizilerden türetilen etiketli probları ve primerleri kapsamaktadır.

Bu problar ve primerler, SARS ile ilişkili bir koronavirüs ile enfeksiyon teşhisi için yararlıdır.

Mevcut buluş ayrıca biyolojik bir örnekten SARS ile ilişkili bir koronavirüsün saptanması için bir yönteme ilişkindir; bu yöntemin özelliği, en azından aşağıdakileri içermesidir: (a) bahsedilen biyolojik numunede bulunan nükleik asitler, (b) ORF-N'nin bir fragmanının, yukarıda tanımlandığı gibi bir çift primer kullanılarak RT-PCR ile amplifikasyonu ve (c) (b) 'de elde edilen amplifikasyon ürünlerinin herhangi uygun bir yolla saptanması.

(B) 'deki amplifikasyon ürünleri (amplikonlar) n 1 primer çifti için 268 bp ve n2 primer çifti için 328 bp'dir.
Adı geçen yöntemin avantajlı bir düzenlemesine göre, saptama (b) aşaması, 28561 ila 28586, 28588 ila 28608.28541 ila 28563 ve 28565 ila 28589 pozisyonlarına karşılık gelen en az bir prob kullanılarak gerçekleştirilir. yukarıda tanımlandığı gibi polinükleotit sekansı.

Tercihen, SARS ile ilişkili koronavirüs genomu saptanır ve isteğe bağlı olarak gerçek zamanlı PCR ile, n2 primeri çifti ve 28541 ila 28563 ve 28565 pozisyonlarına karşılık gelen problar kullanılarak ölçülür.
28589 farklı flüoresan ajanlar dahil olmak üzere farklı bileşiklerle etiketlenmiştir.
Bu primer çiftini uygulayan gerçek zamanlı RT-PCR ve bu prob çok hassastır, çünkü 102 RNA kopyasını ve 10 kopya RNA kopyasını tespit etmeyi mümkün kılar, aynı zamanda güvenilir ve tekrarlanabilir .
Buluş, polideoksiribonükleotitleri ve izole edilmiş koronavirüs suşunun ve yukarıda tanımlandığı gibi fragmanlarının genom sekansına karşılık gelen tek sarmallı, çift sarmallı ve üç sarmallı poliribonükleotitleri ve bunların tamamlayıcı diziler, duyu veya antisens, özellikle yukarıda tanımlandığı gibi genom dizisi ve fragmanlarına karşılık gelen RNA'lar ve cDNA'lar.

Mevcut buluş ayrıca, yukarıda tanımlandığı gibi saflaştırılmış veya izole edilmiş suşun genomuna özgü primerler kullanılarak, özellikle primerler ve primer çiftleri kullanılarak elde edilen amplifikasyon fragmanlarını da kapsar. yukarıda tanımlandığı gibi, yukarıda tanımlandığı gibi fragmanların sekansı tarafından oluşturulan veya sekansı içeren kısıtlama fragmanları, SEK.KİM.NO: 1 sekansını içeren bir vektörden in vitro transkripsiyonla elde edilen fragmanlar veya yukarıda tanımlandığı gibi bir fragmanın yanı sıra kimyasal sentezle elde edilen fragmanlar.

 Kısıtlama fragmanlarının örnekleri, ŞEKİL 13'te gösterilen SEK.KİM.NO: 1 sekansının kısıtlama haritasından çıkarılır. Buluşa göre, bahsedilen fragmanlar ya izole edilmiş fragmanlar biçiminde ya da fragmanların karışımları biçimindedir. Buluş ayrıca, yukarıdaki fragmanların uzunluğuna göre yaklaşık olarak% 15 oranında nükleotitlerin uzaklaştırılması veya ilave edilmesi yoluyla öncekilere göre modifiye edilmiş fragmanları ve / veya modifiye edilmiş nükleotit fragmanları, yukarıda tanımlandığı gibi izolatın genomik veya antijenomik RNA sekansları ile hibridizasyon kapasitesini korur.
Buluşa göre nükleik asit molekülleri, kendi başlarına bilinen geleneksel yöntemlerle, Moleküler Biyolojide Güncel Protokollerde (Frederick M.
AUSUBEL, 2000, Wiley ve oğlu Inc, Kongre Kütüphanesi, ABD). Örneğin,
bir nükleik sekansın PCR veya RT-PCR ile çoğaltılması veya toplam veya kısmi kimyasal sentez yoluyla elde edilebilir.
Mevcut buluş ayrıca bir DNA veya RNA yongası veya filtresiyle de ilgilidir, karakterize edici özelliği, en az bir polinükleotid veya yukarıda tanımlandığı gibi fragmanlarından birini içermesidir.
Buluşa göre DNA ya da RNA çipleri ya da filtreleri, oligonükleotidlerin bir cam ya da naylon desteğe kimyasal ya da elektrokimyasal aşılanması gibi bilinen geleneksel yöntemlerle hazırlanmaktadır.
Mevcut buluş ayrıca bir rekombinant klonlama ve / veya ekspresyon vektörü, özellikle bir plazmid, bir virüs, bir viral vektör veya yukarıda tanımlandığı gibi bir nükleik asit fragmanı içeren bir faj ile ilgilidir. Tercihen adı geçen rekombinant vektör, adı geçen nükleik asit fragmanının, uygun transkripsiyon ve translasyon için düzenleyici elementlerin kontrolü altına yerleştirildiği bir ekspresyon vektörüdür. Ek olarak, bahsedilen vektör, immobilizasyon ve / veya proteinin saptanması ve / veya saflaştırılması için faydalı, bahsedilen insertin 5 've / veya 3' ucuyla faz halinde kaynaştırılmış dizileri (etiketler veya etiketler) içerebilir. adı geçen vektörden ifade edilir.
Bu vektörler, kendi başına bilinen geleneksel rekombinant DNA ve genetik mühendisliği yöntemleri ile konakçı hücrelere oluşturulur ve sokulur. İlgilenilen bir nükleik asit molekülünün, onu bir konakçı hücreye sokmak ve muhafaza etmek için sokulabildiği birçok vektör, kendi başlarına bilinmektedir; uygun bir vektörün seçimi, bu vektör için öngörülen kullanıma bağlıdır (örneğin ilgilenilen sekansın replikasyonu, bu sekansın ekspresyonu, sekansın kromozom dışı formda korunması veya kromozomal materyalin kromozomal materyaline entegrasyonu) (konakçı) ve ayrıca konakçı hücrenin doğası.
Buluşa uygun olarak, bahsedilen plazmid özellikle aşağıdaki plazmidlerden seçilir: - 20 Haziran 2003 tarihinde I-3059 numarası altında bırakılan bakteri suşuna dahil edilen SARS-S adı verilen plazmid, Ulusal Mikroorganizma Kültürleri Koleksiyonu, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; o
"Sekans ID NO: 4) 'e göre 21406 ila 25348 pozisyonlarının nükleotitlerine karşılık gelen sekanstan türetilen SARS-CoV suşunun S proteinini kodlayan cDNA sekansı içerir. Genbanlc AY274119.3, - SARS-S1 adı verilen plazmid, 12 Mayıs 2003 tarihinde Ulusal Mikroorganizma Kültürleri Koleksiyonu, 25 rue du Docteur Roux ile I-3020 numarası altında biriken bakteri suşuna dahil edilmiştir, 75724 Paris Cedex 15; yukarıda tarif edildiği gibi No. 031589 altında listelenen örnekten elde edilen SARS-CoV suşunun protein S'sini kodlayan 5 ′'lik bir fragmanı içerir; bu, 21406 ila 23454 pozisyonlarının nükleotitlerine karşılık gelen fragman (SEK.KİM.NO: 5), Genbank sekansı AY274119.3 Tor2'ye - SARS-S2 adı verilen plazmid, 12 Mayıs 2003'te I-3019 numarası altında bırakılan bakteri suşuna dahil Ulusal Mikroorganizma Kültürleri Koleksiyonu, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; 23322 ila 25348 pozisyonlarının nükleotitlerine karşılık gelen fragman, yukarıda tanımlandığı gibi No. 031589 altında listelenen örnekten türetilen SARS-CoV suşunun protein S'sini kodlayan 3 ′'lik bir fragman içerir. (SEK.KİM.NO: 6), Genbank dizi erişim numarası AY274119.3'e referansla - 13 Kasım'da I-3126 numarası altında biriken bakteri suşuna dahil SARS-SE adı verilen plazmid 2003, Ulusal Mikroorganizma Kültürleri Koleksiyonunda, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; ORF-S ve ORF-E arasında bulunan bölgeye karşılık gelen ve yukarıda tanımlandığı gibi No. 031589 altında listelenen örnekten elde edilen SARS-CoV suşunun ORF-E'siyle çakışan cDNA'yı içerir. yukarıda, Genbank dizisi erişim no AY274119.3'e referansla 25110 ila 26244 pozisyonlarının nükleotidlerine karşılık gelen hangi bölge (SEK.KİM.NO: 8) - bakteri suşunda bulunan SARS-E adı verilen plazmid 28 Mayıs 2003 tarihinde I-3046 numarası altında Ulusal Mikroorganizma Kültürleri Koleksiyonu, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; yukarıda tanımlandığı gibi 031589 numarası altında listelenen örnekten türetilen SARS-CoV suşunun E proteini için kodlayan cDNA dizisini içerir.
Genbank sekans erişim no AY274119.3'e referansla 26082 ila 26413 arasındaki pozisyonların nükleotitlerine karşılık gelen sekans (SEK.KİM.NO: 15), - SARS-M adı verilen plazmid; 28 Mayıs 2003'te Ulusal Mikroorganizma Kültürleri Koleksiyonu, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15 ile birlikte I-3047 numarası altında bırakılan bakteri suşuna dahil edilmiştir; yukarıda tanımlandığı gibi 031589'da listelenen örnekten türetilen SARS-CoV suşunun M proteini için kodlayan cDNA dizisini içerir; Genbank sekans erişim numarası AY274119.3'e referansla 26330 ila 27098 pozisyonlarının nükleotitlerine karşılık gelen sekans (SEK.KİM.NO: 18) - SARS-MN adı verilen plazmid, n I-3125, 13 Kasım 2003, Ulusal Mikroorganizma Kültürleri Koleksiyonunda, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; 031589 numarası altında listelenen ve yukarıda tanımlandığı gibi Hanoi'de toplanan örnekten SARS-CoV suşunun ORF-M ve ORF-N arasındaki bölgeye karşılık gelen cDNA dizisini içerir. 26977 ila 28218 pozisyonlarının nükleotidlerine karşılık gelen sekans (SEK.KİM.NO: 20), Genbank sekansı erişim no AY274119'a referansla. 3, - SARS-N adı verilen plazmid, 5 Haziran 2003 tarihinde I-3048 numarası altında bırakılan bakteriyel suşa dahil, Ulusal Mikroorganizma Kültürleri Koleksiyonu, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15 ; yukarıda tanımlandığı gibi 031589 numarası altında listelenen örnekten türetilen SARS-CoV suşunun protein N'sini kodlayan, 28054 ila 29430 pozisyonlarının nükleotitlerine karşılık gelen cDNA kodlamasını içerir (SEKANS KOD NO .: 38) , Genbank dizi erişimine referans ile AY274119.3; bu nedenle bu plazmid, SEK.KİM.NO: 38 sekansının bir ekini içerir ve 5 Haziran 2003'te Ulusal Mikroorganizma Kültürleri Koleksiyonu ile I-3048 numarası altında bırakılan bir bakteri suşuna dahil edilir, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15 - SARS-5'NC adı verilen plazmid, 7 Kasım 2003 tarihinde Ulusal Mikroorganizma Kültürleri Koleksiyonu ile I-3124 numarası altında biriken bakteri suşuna dahil edilmiştir 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15; genomun kodlamayan 5 ′ ucuna karşılık gelen cDNA'yı içerir
Genbanlc n dizisine atfen, yukarıda tanımlandığı gibi 031589 numarası altında listelenen örnekten türetilen SARS-CoV suşunun, 1 ila 204 arasındaki pozisyonların nükleotitlerine (SEKANS KOD NO .: 39) karşılık gelen sekansın erişim AY274119.3, - SARS-3'NC adı verilen plazmid, 7 Kasım 2003'te I-3123 numarası altında biriken bakteri suşuna dahil, Ulusal Mikroorganizma Kültürleri Koleksiyonu, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15 .; yukarıda tanımlandığı gibi 031589 numarası altında listelenen örnekten türetilen SARS-CoV suşunun genomunun kodlamayan 3 ′ ucuna karşılık gelen cDNA dizisini içerir, bu dizi nükleotit arasında bulunan diziye karşılık gelir 28933 ila 29727 pozisyonunda (SEK.KİM.NO: 40), AY274119.3 Genbank sekans erişimine referansla, bir dizi nükleotit a ile biter. - pIV2.3N adı verilen ekspresyon plazmidi, N proteininin (SEK.KİM.NO: 37) bir polihistidin etiketi ile C-terminal füzyonunu kodlayan cDNA fragmanı - pIV2 adı verilen ekspresyon plazmidi.
3Sc, bir polihistidin etiketi ile protein S (SEK.KİM.NO: 3) amino asit sekansının 475 ila 1193 pozisyonlarına karşılık gelen parçanın C-terminal füzyonunu kodlayan bir cDNA fragmanı içeren - plazmid bir polihistidin etiketi ile protein S (SEK.KİM.NO: 3) amino asit sekansının 14 ila 1193 konumlarına karşılık gelen parçanın C-terminal füzyonunu kodlayan bir cDNA fragmanı içeren pIV2.3SL ifadesi - N proteininin (SEK.KİM.NO: 3) bir polihistidin etiketi ile N-terminal füzyonunu kodlayan bir cDNA fragmanı içeren pIV2.4N adı verilen ekspresyon plazmidi - pIV2 adı verilen ekspresyon plazmidi. 4Sc veya pIV2. 4S proteininin (SEK.KİM.NO: 3) amino asit sekansının 475 ila 1193 pozisyonlarına karşılık gelen fragmanın bir polihistidin etiketi ile N-terminal füzyonu için bir ek kodlayan bir ek ve - plazmid pIV2.4SL adı verilen ifade, buna karşılık gelen fragmanın bir N-terminal füzyonu için kodlanan bir cDNA fragmanı içerir
bir polihistidin etiketi ile protein S'nin (SEK.KİM.NO: 3) amino asit sekansının 14 ila 1193 arasındaki pozisyonları.
Yukarıda tanımlandığı gibi ekspresyon plazmidinin avantajlı bir düzenlemesine göre, 23 Ekim 2003'te Ulusal Mikroorganizma Kültürleri Koleksiyonu, 25, I-3117 numarası altında biriken bir bakteri suşuna dahil edilir. rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15.
Yukarıda tanımlandığı gibi ekspresyon plazmidinin bir başka avantajlı düzenlemesine göre, 23 Ekim 2003'te Ulusal Mikroorganizma Kültürleri Koleksiyonu ile I-3118 numarası altında biriken bir bakteri suşuna dahil edilir, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15.
Yukarıda tanımlandığı gibi ekspresyon plazmidinin başka bir düzenlemesine göre, CNCM, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15'te aşağıdaki sayılar altında biriken bir bakteri suşuna dahil edilir: a) suş n 23 Ekim 2003'te bırakılan I-3118, b) 12 Mayıs 2003'te bırakılan n-I-3019 suşu, c) 12 Mayıs 2003'te bırakılan n-I-3020 suşu, d) 20 Haziran'da bırakılan n-I-3059 suşu 2003, e) 22 Kasım 2004'te bırakılan suş I-3323, 22 Kasım 2004'te bırakılan suş I I-3324, g) 1 Aralık 2004'te bırakılan suş I I-3326, h) suş I-3327, Aralık 2004'te bırakılan, i) Aralık 2004'te bırakılan suş I-3332 suşu, j) 1 Aralık 2004 tarihinde bırakılan suş I I-3333 suşu, lc) Aralık 2004'te bırakılan suş I-3334 suşu, 1) 1 Aralık 2004'te bırakılan n-I-3335 suşu, m) 1 Aralık 2004'te bırakılan n-I-3336 suşu, n) 1 Aralık 2004'te bırakılan n-I-3337 suşu, o) n dosyalandı 2 Aralık 2004, p) kadife çiçeği 2 Aralık 2004'te bırakılan I-3339, q) 2 Aralık 2004'te bırakılan n-I 3340 türü, r) 2 Aralık 2004'te bırakılan I-3341 türü.
Mevcut buluş ayrıca viral kaynaklı bir nükleik asit eki ile de ilgilidir, karakterize edici özelliği, yukarıda a) -r) 'de tanımlandığı gibi suşların herhangi birinde yer almasıdır.
Mevcut buluşun konusu ayrıca, ökaryotik hücrelerde protein S'nin optimize edilmiş ekspresyonuna izin veren sentetik bir geni içeren bir nükleik asit olup, karakterize edici özelliği, SEK.KİM.NO: 140 dizisine sahip olmasıdır.
Mevcut buluş ayrıca, Aralık 2004'te CNCM'de biriken bakteri suşunda bulunan protein S'nin optimize edilmiş bir ekspresyonuna izin veren sentetik bir gen içeren bir nükleik asit içeren bir ekspresyon vektörü ile de ilgilidir. Hayır. I-3333.
Adı geçen ekspresyon vektörünün bir düzenlemesine göre, bir viral partikül formunda veya bir rekombinant genom formunda bir viral vektördür.
Bu düzenlemenin avantajlı bir düzenlemesine göre, bir plazmidin g), h) ve lc) 'ye göre transfekte edilerek elde edilebilen bir rekombinant viral partikül veya rekombinant viral bir genomdur. r) yukarıda tanımlandığı gibi, uygun bir hücresel sistemde, örneğin, vektörde silinmiş virüsün belirli fonksiyonlarını tamamlamak üzere tasarlanan bir veya daha fazla başka plazmid (ler) ile transfekte edilmiş hücreler ve viral partiküllerin oluşumu için gereklidir.
Protein S ailesi terimi, burada tercihen bir ökaryotik sistemde üretilen tam protein S, ektodomain ve bu ektodomain fragmanları anlamına gelir.
Mevcut buluş ayrıca yukarıda tanımlandığı gibi protein S ailesinin bir polipeptidini kodlayan bir lentiviral vektör ile de ilgilidir.
Mevcut buluş ayrıca yukarıda tanımlandığı gibi protein S ailesinin bir polipeptidini kodlayan bir rekombinant kızamık virüsü ile ilgilidir.
Mevcut buluş ayrıca yukarıda tanımlandığı gibi protein S ailesinin bir polipeptidini kodlayan bir rekombinant aşı virüsü ile ilgilidir.
Mevcut buluş ayrıca yukarıda tanımlandığı gibi e) ila r) paragraflarına göre bir vektörün veya yukarıda tanımlandığı gibi protein S için sentetik bir genin eksprese edilmesini içeren bir vektörün kullanımı ile ilgilidir. , bir ökaryotik sistemde, SARS ile ilişkili koronavirüsün S proteininin veya bu proteinin bir fragmanının üretimi için.
Mevcut buluş ayrıca, ökaryotik bir sistemde protein S'nin üretilmesi için bir yöntem ile ilgilidir; bu yöntem, kültürdeki ökaryotik hücrelerin, e) ila r) ci paragraflarında belirtilen bakteri suşlarında bulunan vektörlerden seçilen bir vektör ile transfeksiyon aşamasını içerir. yukarıda veya S proteininin optimize edilmiş ekspresyonuna izin veren sentetik bir gen içeren bir vektör.
Mevcut buluşun konusu ayrıca, yukarıda tanımlandığı gibi fragmanlar, özellikle bir rekombinant vektörde, özellikle bir vektör içinde klonlanmış amplifikasyon fragmanları veya kısıtlama fragmanları içermesiyle karakterize edilir. ifade (ifade bankası).
Mevcut buluş ayrıca yukarıda tanımlandığı gibi bir rekombinant vektör tarafından modifiye edilmiş hücreler, özellikle prokaryotik hücreler ile ilgilidir.
Mevcut buluş ayrıca aşağıda tanımlandığı gibi bir proteini veya bir polipeptidi eksprese eden genetik olarak modifiye edilmiş bir ökaryotik hücre ile ilgilidir. Açıkçası, "genetik olarak değiştirilmiş ökaryotik hücre" terimleri, vahşi bir virüs tarafından değiştirilmiş bir hücreyi tanımlamaz.
Adı geçen hücrenin avantajlı bir düzenlemesine göre, yukarıdaki i) ila 1) paragraflarında belirtilen vektörlerin herhangi biri ile transfeksiyon yoluyla elde edilebilir.
Bu düzenlemenin avantajlı bir düzenlemesine göre, 22 Kasım 2004 tarihinde CNCM'de I-3325 numarası altında bırakılan FRhK4-Ssol-30 hücresidir.
Yukarıda tanımlandığı gibi rekombinant vektörler ve adı geçen ekspresyon vektörleri tarafından transforme edilen hücreler, ilgili proteinlerin ve peptitlerin üretimi için avantajlı bir şekilde kullanılır. Adı geçen vektörlerden türetilen ekspresyon kütüphaneleri ve adı geçen kütüphaneler tarafından dönüştürülen hücreler
SARS ile ilişkili koronavirüs proteinlerinin immünojenik epitoplarını (epitop B ve T) tanımlamak için avantajlı olarak kullanılır.
Mevcut buluşun konusu ayrıca proteinler ve saflaştırılmış veya izole edilmiş peptitlerdir, karakterize edici özelliği, bunların polinükleotit veya yukarıda tanımlandığı gibi fragmanlarından biri tarafından kodlanmasıdır.